在药物非临床安全性评价中，未见不良反应剂量（NOAEL, No Observed Adverse Effect Level） 的确定是目标之一，也是衔接临床研究剂量设定的关键依据。其表面定义虽简单，但实际判定过程需要深入思考。
通常情况下，NOAEL 指在特定试验条件下，与对照组相比，未观察到与供试品相关的毒性反应发生的最高剂量。如下图所示，NOAEL位于有效剂量（Effective Dose）与明显毒性剂量（Overt Toxicity）之间。它是安全剂量范围（MOS, Margin of Safety） 的计算基础（MOS = NOAEL /有效剂量），为首次人体试验（FIH）的起始剂量提供毒理学依据。判定NOAEL时，研究者需综合评估实验动物的一般状态、临床病理学指标和组织学检查结果。
图1 毒理学剂量-反应范围示意图
判定NOAEL的前提是明确界定什么是有害作用（Adverse Effect, AE）。AE通常指对机体造成有害影响的变化，其特征包括：
影响机体正常状态
损害正常形态结构、生理功能、生长发育或寿命，如脏器重量显著改变伴随功能异常、生长发育迟缓、寿命缩短；
损害机体功能容量
动物摄食量、运动负荷能力、生化指标、行为学等发生不良改变；
降低代偿能力
机体应对环境压力或化学物质刺激的能力下降，如药物刺激导致流涎/呕吐本是代偿性排出毒物的机制，若该功能受损则属AE；
破坏内稳态（Homeostasis）维持能力
如过度发热超过机体调节能力导致惊厥昏迷；
增加对有害因素的易感性
如免疫抑制剂导致CD20+ B细胞耗竭，显著增加感染风险；
其他进行性、不可逆或严重损伤。
AE与非AE的区别
AE与非AE（Non-adverse Effect，非AE）都可能涉及功能性损伤、组织学损伤、适应性反应、继发性反应和一过性反应，关键在于对反应性质的综合判断。一过性反应本身是中性的，是否为AE需要结合其程度和范围等因素综合判断。如运输应激导致的丙氨酸氨基转移酶（ALT）短暂升高，这种指标变化通常在正常阈值范围内，影响也相对单一（仅ALT指标，无其他关联肝损伤证据），且可逆，故通常视为非AE。如果超过正常范围，且有一定的变化幅度和效量关系，则可考虑为AE。
因不同种属间存在代谢途径、敏感性、修复能力等差异，AE具有种属特异性。某种不良反应超出该种属的适应阈值，导致功能性损伤或病理改变，属于AE；但相同的反应在另一种属中可能仅为生理性适应反应，则被归类为非AE。而非AE则不具备种属特异性，所有的动物都可能出现相似的变化。
表1 AE与非AE的区别
改变的性质 | AE | 非AE |
功能性损伤 | ✔ | ✔ |
组织学损伤 | ✔ | ✔ |
适应性反应 | ✔ | ✔ |
继发性反应 | ✔ | ✔ |
一过性反应 | ✔ | ✔ |
反应程度 | 超出域值 范围 | 域值范围内 |
涉及范围 | 关联指标 | 单一、相对 独立 |
种属特异性 | ✔ |
NOAEL判定是一个基于权重证据（Weight of Evidence） 的综合分析过程，需系统性地关注一系列关键问题。
1
药理作用放大延伸 & 继发效应
NOAEL的判定需区分预期药理学作用的放大与延伸，及由此产生的继发效应，并考虑Hormesis （毒兴奋效应）的可能性。以长效促红细胞生成素（EPO）重复给药为例：
预期药理学效应：长期EPO的预期药理作用是刺激红细胞生成。因此观察到的外周血和骨髓红细胞指标升高、血液粘度增加、脾脏髓外造血以及多脏器的淤血/充血性改变，应视为药理学作用本身的直接或延伸效应，通常划归为非AE。
继发损伤：然而，当药理学效应过度放大，如红细胞过度增多、血液粘度过高时，会引发严重的继发性病理生理改变。这可能导致心脏、肝脏、肾脏等主要脏器的实质性损伤和血栓形成，甚至最终造成动物死亡。此类由药效过度放大直接导致的组织损伤甚至死亡属于AE。
免疫介导毒性：此外，重复给药可能诱发机体产生抗药抗体（ADA）。这些抗体若中和了内源性的EPO，将导致继发性贫血。这种由免疫反应介导、偏离药物预期药理作用的毒性效应，也属于明确的AE。
2
Hormesis
Hormesis 是指特定类型的致毒或应激因素，如化学毒物、辐射、热、机械刺激等，在不同剂量水平下对生物体产生截然相反效应的现象。高剂量暴露：通常产生有害效应，如细胞损伤、功能障碍或死亡；低剂量暴露：反而可能产生有益效应。其机制在于，低剂量毒物对机体内稳态产生微干扰，激活了生物体一系列适应性反应、修复和维持机制。比如通过激活特定转录因子和激酶信号通路，增加细胞保护和修复性蛋白的表达。
这一现象符合经典的Arndt-Schulz定律，即弱刺激可激活生理功能，中等强度刺激可促进生理功能，强刺激则抑制，极强刺激导致死亡。日常生活中，拔火罐、刮痧等传统疗法被视为Hormesis效应的案例，其原理是通过可控的局部物理损伤，引发适度的全身性应激反应。研究表明，刮痧可导致白细胞和白细胞介素-6（IL-6）水平升高，进而刺激免疫细胞增殖与活化，增强机体免疫功能；同时诱导超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，从而增强机体抗氧化防御系统的能力。这些效应正是低剂量刺激可激活机体保护性应答的体现。
3
改变时间的短暂性
在NOAEL判定中，需特别关注观察指标变化的持续时间。若某种改变仅呈现短暂性、一过性特征，且能自发恢复或快速代偿，通常可视为非AE。如灌胃（ig）给药体积较大，给药初期动物可能出现短暂、非特异性的摄食量减少和体重下降，但随后机体通过适应机制恢复正常生长状态；因试验操作引发的一过性血清ALT升高，属于应激反应，脱离刺激后可迅速恢复；某些指标的轻微变化在生理范围内呈现周期性或波动性，通常与药物毒性无关。
4
动物特有的反应
判定NOAEL时，需明确识别并排除仅在实验动物中发生且与人类无关的生物学反应。
解剖结构差异：如啮齿类动物缺乏胆囊，其胆汁代谢途径与人类本质不同，相关改变不可外推至人。
特有器官/组织反应：大鼠前胃（非腺性胃）是啮齿类特有结构，药物诱导的角化过度或溃疡等病变通常不视为人类风险信号；啮齿类哈氏腺（Harderian Gland）可分泌含卟啉的色素，导致“红泪症”（眼/鼻红色分泌物），此为动物生理性或应激性反应，与毒性可能无直接关系。
特有生理机制：如啮齿类动物门齿终生持续生长，药物影响牙齿生长的效应因人类无此生理特性而无相关性。
特有表达或功能靶点：例如PCSK9受体在孕鼠肝脏中高表达，若药物在此模型中出现肝毒性，需评估该靶点表达水平是否与人类存在种属差异。
5
适应性/代偿性反应
适应性/代偿性反应是指机体为维持内稳态，对药物或外界刺激产生的可逆性、功能性调整。此类反应虽偏离基线水平，但不造成进行性组织损伤或功能障碍，通常可归类为非AE。典型类型包括：
生理性代偿：如因频繁采血导致贫血时，机体通过网织红细胞代偿性增加以加速红细胞生成，属生理性造血系统代偿。
代谢适应：药物（如部分中药）高剂量给药时，可能诱导肝脏代谢酶活化，导致肝脏重量增加（肝酶诱导性肥大），此为器官对代谢负荷增加的适应性改变。
功能性适应：肾脏小管上皮细胞肥大，是肾小管为增强排泄功能而主动增加跨细胞转运能力的适应性反应，旨在维持溶质平衡，而非器质性损伤。
6
独立的改变还是与其他改变相关联
判定NOAEL时，需严格区分孤立性指标变化与关联性病理改变。若某指标变化未伴随其他病理或功能异常，且可明确归因于非毒性机制（如生理波动、方法学干扰或适应性反应），则通常视为非AE。如单纯尿素（UREA）降低，无血清肌酐升高、肾组织学损伤或脱水证据，可能仅反映蛋白摄入减少或肝代谢变化，不构成肾毒性信号；若同时伴随肌酐升高、肾小管坏死或肾小球滤过率下降，表明存在进行性肾损伤，可判定为AE。
7
特征性生物标志物改变
某些生物标志物的改变具有器官特异性。肝酶谱升高是肝细胞损伤/坏死的特征性标志，心肌酶谱升高是心肌细胞损伤/坏死的特异性信号。此类标志物的升高幅度需与组织病理学损伤程度相关联，若标志物变化独立存在且无剂量依赖性，可能无生物学意义；若显著升高且伴随相应器官组织病理损伤或功能障碍，则判定为AE。
8
继发于其他不良反应
继发性反应是由已明确的有害反应或严重生理失衡间接引发的连锁效应，其本身虽表现为指标异常，但不构成独立的毒性机制。若继发性反应可随原发AE的终止而逆转，且未造成新的不可逆损伤，则其危害性通常归因于原发事件；但当继发性反应突破机体代偿极限，如重度贫血导致多器官缺氧性损伤，或形成自我维持的恶性循环时，应独立判定为AE。
常见的继发性反应包括继发于体重降低的脏器重量降低（脏脑比相对恒定）；继发于体重降低的性成熟推迟；继发于局部效应，如皮肤给药局部严重刺激引起摄食量减少、体重降低；继发于CD20+ B细胞耗竭后的免疫功能下降(易感染等)等。
9
试验操作引起
试验操作相关的干扰因素可能引发动物生理指标的短暂改变，此类改变需严格区别于药物毒性，并在NOAEL判定中予以排除。如动物抓取、保定或运输可激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，导致血清皮质酮升高、白细胞计数波动等应激性改变；受试物的特殊气味或不良口感可能直接降低动物摄食意愿，引发摄食量减少、体重增长抑制或焦虑样行为；注射针头对给药部位的机械刺激可能造成局部炎症、水肿或组织损伤，若未超出操作预期范围且可快速修复，不视为药物毒性。
10
改变程度/背景病变程度加重或发生率增加
对易受干扰的指标，如QT间期受心率（HR）影响，需通过校正排除干扰。若药物导致背景病变的严重程度显著加剧，如大鼠的慢性进行性肾病（CPN）从局灶性轻微损伤进展为弥漫性肾小管坏死，或发生率显著高于对照组，或诱发继发性不可逆损伤，如CPN基础上出现肾脏矿化、尿毒症或肾功能衰竭，则明确归类为AE。
11
动物器官功能的影响
判定NOAEL时，需结合器官功能的易干扰性和判定特异性进行严谨分析。胸腺作为免疫敏感器官，易受年龄、应激等非药物因素影响。若药物作用与此类背景变化重叠，需通过严格年龄匹配的对照组和应激控制来区分药物特异性作用。
生殖器官的重量与动物年龄、性成熟状态密切相关。未成熟动物的生殖器官处于快速发育期，重量随日龄呈指数级增长；动物达到性成熟时，生殖器官因激素激增出现较明显的增重；性成熟后，重量趋于稳定，波动主要受动情周期/精子发生周期影响。若在发育期给药，其效应可能被生理性增重掩盖；若在成熟期给药，生理波动易被误判为药物效应。试验设计时需通过阴道涂片或包皮腺分离确认性成熟状态，确保给药组与对照组处于相同发育阶段。
NOAEL判定是一个递进式、基于权重证据的决策过程：
1 | 相关性确认 首先确认观察到的改变是否与供试品相关。若无关，如操作应激或自发疾病，可判定为非AE； |
2 | 时效性验证 对于与供试品相关的改变，需验证其是否与给药周期匹配。无时效关系视为非AE。这点需结合其他证据综合判断； |
3 | 统计学差异评估 对于既相关又有时效性的改变，需进一步评估统计学差异。若无统计学差异但存在明确生物学意义，如剂量依赖性、病理损伤等，仍可能判定为AE；若有统计学差异，则需基于整体证据权重（WOE） 综合评估——包括统计学生物学一致性、剂量/时间梯度性、可逆性/进行性及动物-人类相关性； |
4 | 若缺乏生物学差异，判定为非AE；反之则确认为AE。流程核心是优先生物学意义而非单纯统计学阈值，且严格排除非药物相关干扰。 |
NOAEL的判定是一个整合生物学意义与统计学差异的综合评估过程。需特别强调，即使某种反应未达到统计学显著性，只要具有明确的生物学意义，也需纳入AE评估范畴。
此外，NOAEL 不等同于无风险剂量，仅表示在当前试验条件下未检测到不良反应，可能受限于样本量、观察指标或暴露时长。
抗肿瘤药物可能因固有细胞毒性而无法确定NOAEL，此时需通过替代指标，如STD₁₀（10%动物出现严重毒性反应的剂量）、MTD（最大耐受量）或HNSTD（最高非严重毒性剂量）确定首次人体试验剂量（FIH）。
参考文献
1. Vijay P. Kale, Ilona Bebenek, Hanan Ghantous, et al. Practical Considerations in Determining Adversity and the No-Observed-Adverse-Effect-Level (NOAEL) in Nonclinical Safety Studies: Challenges, Perspectives and Case Studies. International Journal of Toxicology，2022, 41(2)：143–162. DOI：10.1177/10915818211073047
2. Paul Baldrick, Mary Ellen Cosenza, Tessie Alapatt, et al.Toxicology Paradise: Sorting Out Adverse and Non-adverse Findings in Animal Toxicity Studies. International Journal of Toxicology, 2020,39(5)：365–378. DOI：10.1177/1091581820935089
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2025-07-27
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