在探索生命奥秘的征程中，理解蛋白质如何与DNA“对话”，精准调控基因的开启与关闭，是表观遗传学研究的核心命题。自1984年染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）技术诞生以来，这员功勋卓著的“老将”在数十年的时间里稳坐绘制蛋白质-DNA相互作用图谱的“金标准”宝座，为我们揭示转录因子结合、组蛋白修饰、染色质重塑等关键调控机制立下了汗马功劳。然而近十年来，面对愈发复杂的基因组调控网络和更高分辨率的研究需求，ChIP-seq因其固有的局限性而显得“力不从心”。“江山代有才人出”，一批旨在克服其短板、拓展疆域的革新方法应运而生，正逐步成为解析蛋白质-DNA互作图景不可或缺的“生力军”甚至“新标准”。

ChIP技术的核心思想是在活细胞状态下，利用化学交联剂（最常用的是甲醛）将细胞内正在发生的蛋白质-DNA相互作用固定下来，形成稳定的复合物。随后，细胞被裂解，通过超声破碎或酶切将染色质随机打断成适宜大小（通常在200-1000 bp）的片段。接下来是ChIP技术的关键——免疫共沉淀：利用针对目标蛋白（如特定的转录因子、修饰的组蛋白）的特异性抗体，从复杂的染色质片段混合物中，将与目标蛋白紧密结合的DNA片段沉淀下来。经过洗涤去除非特异性结合后，DNA被解交联释放并纯化，最终获得富集了目标蛋白结合位点的DNA片段。

ChIP获得的这些DNA片段既可以通过构建测序文库通过高通量测序（即ChIP-seq）在全基因组范围内精确定位目标蛋白的结合位置，也可以结合定量手段（如ChIP-qPCR）对特定位置的富集丰度或差异进行比较。

图： ChIP实验方法，来自CST官网

然而随着生命科学研究不断向单细胞分辨率、微量样本分析、更高信噪比以及更高通量的方向迈进，ChIP这位久经沙场的“老将”也逐渐显露出其固有的局限性：

上述挑战促使科学家们不断寻求创新与突破。近年来，一批强有力的“挑战者”技术应运而生，开始撼动ChIP的金标准地位，引领表观遗传学研究进入新的纪元。

在表观遗传学研究中，ChIP技术数十年来一直是检测蛋白质-DNA相互作用的金标准。然而，在2016年后，随着CUT&Run（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）和CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术的诞生，这一格局发生了松动。其中CUT&Tag技术凭借其高效、低噪的特性，正逐渐成为染色质分析的新标杆。

和ChIP技术的明显区别在于，CUT&Tag的采用"原位标记"策略，将抗体引导的Tn5转座酶直接靶向目标蛋白结合位点，在Mg²⁺存在下切割DNA并同步插入测序接头。这一策略在一定程度上克服了ChIP技术中的部分固有缺陷。其中包括：

图： CUT&Tag技术路线

基于上述的优势，CUT&Tag已成功应用于多种场景，如最近开发的“空间CUT&Tag”技术可定位组织切片中特定染色质标记的空间分布，同时CUT&Tag还可以脱离蛋白靶标的限制，对DNA G-四链体、R-loop等高级核酸结构的互作图谱进行绘制。以上应用是传统ChIP所难以企及的，这充分体现了CUT&Tag技术广阔的前景。

尽管优势显著，但CUT&Tag技术仍远未达到“十全十美”的境界，其依然面临着几个重大挑战，在开展CUT&Tag实验时，下面几个问题尤其值得注意：

随着自动化与多组学整合技术的发展，CUT&Tag正推动表观遗传研究进入单细胞与空间分辨率时代。其在细胞异质性、发育生物学及临床诊断中的应用潜力，使其成为后基因组时代不可或缺的工具。尽管ChIP技术仍具价值，但CUT&Tag的高效性与灵敏度正重新定义染色质分析的黄金标准。

最近有一项有趣的技术被报道，这种名为“基于CRISPR-dCas9系统的反向染色质免疫沉淀技术”（R-ChIP-dCas9）旨在精确鉴定与特定DNA区域（如基因启动子）结合的蛋白质，革新了我们对于转录调控机制的研究方式。

R-ChIP-dCas9技术的核心在于巧妙地利用了CRISPR-Cas9基因编辑系统的“导航”能力。研究人员将首先将失去了切割活性的Cas9蛋白（dCas9）融合了链霉亲和素结合纯化标签Strep-Tag II，并设计向导RNA（gRNA）精确引导dCas9-Strep复合物结合到基因组上特定的目标DNA区域（例如某个感兴趣基因的启动子）。通过瞬时转染技术将表达dCas9-Strep和gRNA的载体导入目标细胞使得gRNA-Cas9复合物在活细胞内精确结合目标DNA。

后续工作同一般ChIP实验类似，首先需要甲醛交联固定细胞，然后破碎细胞核将染色质超声打断成小片段。与普通ChIP不同的是，由于复合体已经携带了纯化标签，我们就可以利用Strep-Tag II与链霉亲和素磁珠的强亲和力将结合了目标DNA片段的dCas9-Strep复合物（及其连带结合的所有蛋白质）高效地从裂解液中纯化出来。经洗脱后，通过质谱分析即可鉴定出所有结合在该目标DNA区域的蛋白质。

图  R-ChIP–dCas9的原理

与传统的酵母单杂或依赖DNA探针的反向ChIP系统相比，基于CRISPR的R-ChIP-dCas9技术结合特异性远超传统方法。测试数据也显示，目标DNA区域的富集效率高达1000-1500倍。同时，该技术的探针-DNA结合步骤在活细胞内完成，使得其结果更接近真实生理状态。研究者成功地将该技术应用于植物（桦树），鉴定出了关键耐旱基因BpNAC090的多个潜在上游转录因子。

染色质免疫共沉淀（ChIP），这员在表观遗传学疆域驰骋数十年的“老将”，以其扎实的理论基础和广泛的应用验证，奠定了我们理解蛋白质-DNA相互作用的基础。它的贡献不容置疑，至今仍在许多标准化、大样本量的研究中发挥着重要作用。

然而，科学探索的脚步永不停歇。面对单细胞、微量样本、高分辨率和高通量等新时代需求，ChIP技术显露的局限，如同一声声叩问：“尚能饭否？”而在叩问声中，以CUT&Tag为代表的高效、低噪、微量兼容技术，和以R-ChIP-dCas9为代表的精准靶向技术等“新锐力量”蓬勃兴起。它们凭借创新的原理设计，在灵敏度、分辨率、通量和应用场景上实现了显著突破，正在快速拓展染色质分析的边界，甚至重新定义“黄金标准”。

技术的迭代并非简单的取代，而是互补与升级。ChIP的深厚积淀为新技术的验证提供了参照，而新技术的锋芒则为解决传统难题开辟了新径。它们如同并肩作战的伙伴，共同推动着表观遗传学研究驶向更广阔深邃的海洋。在后基因组时代，无论是坚守经典的“老将”，还是锐意进取的“新兵”，都将继续在揭示生命调控奥秘的征途上，各展所长，共同绘制更加精细、更加动态的基因调控蓝图。而对于研究者而言，明智地选择并融合这些强大的工具，将是解锁下一个重大发现的关键钥匙。

参考文献

Kaya-Okur H S, Wu S J, Codomo C A, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1930.

Wang Z, He Z, Liu Z, et al. A reverse chromatin immunoprecipitation technique based on the CRISPR–dCas9 system[J]. Plant Physiology, 2023, 191(3): 1505-1519.